Microorganisms Characteristics on the Surface of the Different Biocarriers
吕宣惠 LV Xuan-hui
（江苏大众水务集团有限公司，徐州 221111）
（Jiangsu Volkswagen Water Group Co.，Ltd.，Xuzhou 221111，China）
摘要：水温9.3~14℃、水交换周期为168h的条件下，构建了两组平行的玉米麸基质组合式浮床（Integrated floating bed with corn flakes，简称IFB - CF）和轻质陶粒基质组合式浮床（Integrated floating bed with light ceramsite，简称IFB - LC），研究了不同载体表面微生物种群特性差异。结果表明：采用Miseq高通量测序表征方法对IFB - CF和IFB - LC上基质表面微生物群落结构和多样性进行表征：玉米麸表面有15个门类，165个属类，78个科类，丰度最高的门类、属类、科类分别是Proteobacteria（48.29%）、Trichococcus（10.39%）)、Comamonadaceae（12.45%）。轻质陶粒表面有15个门类、144个属类、93个科类，丰度最高的门类、属类、科类分别是Proteobacteria（46.10%）、Dyadobacter（22.67%）、Cytophagaceae（28.75%）。IFB - LC和IFB - CF的Chao，ACE，Shannon和Simpson指数分别为4081，6295，5.10 和0.05；4938，7461，5.77和0.02。
Abstract: To investigate the effect of combined floating beds on nutrient removal under low temperature, an integrated floating bed with corn flakes (IFB-CF) and an integrated floating bed with light ceramsite (IFB-LC) were constructed in parallel. IFB-LC was used as control group under water temperatures of 9.3~14℃ and a water exchange time of 168h. The microbial population characteristics of the combined floating bed were investigated. Using the MiSeq high throughput sequencing method, we analysed microbial community structure and diversity on the base material surface of the IFB-CF and IFB-LC. The results showed 15 phyla, 165 genera, and 78 families on the surface of the IFB-CF. The phylum, genus, and family with the highest abundances were Proteobacteria (48.29%), Trichococcus (10.39%), and Comamonadaceae (12.45%), respectively. We identified 15 phyla, 144 genera, and 93 families on the surface of the IFB-LC. The phylum, genus, and family with the highest abundances were Proteobacteria (46.10%), Dyadobacter (22.67%), and Cytophagaceae (28.75%), respectively. The Chao, ACE, and Shannon & Simpson indices for the IFB-LC were 4081, 6295, and 5.10, and 0.05, respectively.
关键词：组合式浮床；高通量测序；微生物多样性分析
Key words: combined floating bed；high throughput sequencing；microbial community structure
中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2019）35-0238-03
0 引言
因过量的营养盐排入江河湖库等地表水体，使地表水体呈现出较严重的富营养化污染[1，2]。全球30%-40%的湖泊和水库正在遭受不同程度水体富营养化污染，并有少数湖泊存在黑臭现象、植物种类减少和水空间萎缩等问题。例如：西班牙800座水库中，有1/3处于重度富营养化。我国湖泊富营养化发展速度很快，进入21世纪后，水体富营养化问题全面爆发，如：太湖、滇池和巢湖等我国重要湖泊藻类疯涨备受关注。至今，我国重度富营养化湖泊达66%以上，超富营养化湖泊达22%以上。富营养化水体处理刻不容缓，富营养化水体在外源污染截留以后，内源污染仍然会起作用，引起生态失调、多样性退化和修复能力弱化问题。常见的方法有物理的、化学的和物化的以及生物-生态的等方法，从工程造价、可持续净化和运行维护等角度出发，生物-生态技术是最廉价、最成熟和环境友好程度最高的工艺[3-5]，如：活性污泥法、生物膜法、人工湿地法和土地处理法等等，采用生物-生态技术进行富营养化水体具有水质提升和生态改善双重效果，有利于协同解决水体富营养化问题。其中生物膜法是地表水体水质净化的首选工艺，具有微生物浓度高、净化效果好、产泥少等优点，被广泛应用于富营养化水体的净化处理[6-8]。
生物载体（简称：载体）是生物膜增殖的介质，其特性决定了生物膜特性，包括生物膜形成速度、生物膜质量、微生物种群多样性等等，载体的研发和优化是国内外广泛关注的重点[9]。水体净化研究和工程实践过程中选择合适的载体非常重要，它决定了目标污染物的去除效果、净化速率和动力消耗以及二次污染问题等等诸多问题，备受关注[10，11]。
本试验选的水芹是冬春季节净化重污染河道的经济有效生物材料，水芹浮床在9.3~14℃水温下对氮磷污染物都可以保持较高的去除率和较强的生命力。同时选用玉米麸（农业废弃物）作为基质，并对系统进行微曝气，改善传质效果。本试验的目的研究玉米麸和陶粒表面微生物物种多样性特征，为相关理论研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 浮床基质
玉米麸：取自徐州市云龙区周边农村地区玉米棒芯通过人工剪裁成约为1cm×1cm×1cm方形，表面粗糙较好，用自来水连续浸泡两周（每天换水1次），消除玉米麸表面容易脱落的有机颗粒或组织内含物，防止试验过程中出现二次污染，孔隙率约为68%，比表面积约为380m2/m3。轻质陶粒：表面粗糙，粒径为5-8mm、孔隙率约为65%、比表面积约为360m2/m3。
1.2 生态浮床植物的选取与种植
水芹（Oenanthe javanica）试验前将购自植物培育基地的水芹根系洗净，并曝气培育15天，试验时将水芹育苗统一修剪为15cm，并移栽到生态浮床基质中。水芹露出填料高度约为8cm，其余埋在基质中，两组生态浮床中水芹栽种间距（3cm）均相同。
1.3 原水
取自徐州工程学院中心校区二期学生公寓楼下的湖水，在湖水中加入一定量的氯化铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、葡萄糖和奶粉（雀巢牌），使COD为76.50~88.40mg/L，NH4+-N为13.60~14.60mg/L，TN浓度为19.70~21.80mg/L，TP浓度为0.95~1.25mg/L，pH值为7.36~8.63。试验日期为2016年11月22日至2017年2月13日，水温9.3~14℃，1月1日在生态浮床基质上剥落下的生物膜中发现了较为丰富的钟虫和少量的轮虫。
1.4 浮床组成和试验方法
生态浮床由床体框架、水芹、基质组成。生态浮床床体框架使用能过水的塑料圆柱形水培篮，内径为20cm，深度为18cm，每个水培篮内玉米麸或轻质陶粒填充量分别为3.5升，共2个。将其移入有效容积为100L的长方体水箱，构建生态浮床系统。
每组生态浮床设置3个平行的生态浮床，每个生态浮床中的基质、水芹、水质等保持相同，其中一组是以玉米麸为基质的组合式浮床（Integrated floating bed with corn flakes，简称IFB-CF），另一组是以轻质陶粒为基质的组合式浮床（Integrated floating bed with light ceramsite，简称IFB-LC）。使用风机进行水面微曝气，使溶解氧维持在2.23~3.25mg/L；采用序批式处理的方法，分别于每次换水后的12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h取样测量。在水箱的5处不同位置采集表层水样，取混合后水样装入已灭菌的采样瓶中，2小时内完成检测分析。
1.5 样品采集及分析
微生物多样性表征：将取自IFB-CF和IFB-LC中的具有完整生物膜的玉米麸和陶粒放入经灭菌后的具塞玻璃瓶中（内置冰盒）快递给江苏中宜金大分析检测有限公司，通过高通量DNA测序仪（Illumina Hiseq、Miseq）、高通量蛋白测序仪（Orbitrap）对轻质陶粒和玉米麸表面的微生物进行测定。首先完成对填料表面微生物基因组DNA的提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。按指定测序区域，设计合成带有“5’barcode -引物- barcode 3’”的特异引物，通过PCR扩增技术，要求产物纯化，定量，均一化。为保证后续数据分析的准确性及可靠性，需满足两个条件：①尽可能使用低循环数扩增；②保证每个样品扩增的循环数一致。随机选取具有代表性的样品进行预试验，确保在最低循环数中使绝大多数样品能够扩增出浓度合适的产物。全部样品按照正式试验条件进行，每个样品3个重复，将同一样品的PCR产物纯化混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用Qubit进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。最后加入TruSeq DNA HT Sample Prep Kit；MiSeq Reagent Kit v2试剂建立文库，进行Miseq高通量测序。
2 结果与分析
COD浓度随时间的变化如图1所示。IFB-LC和IFB-CF对COD的平均去除率分别为86.89%和66.06%。相对于IFB-CF而言，IFB-LC的去除效果较好。IFB-CF中有机物在被水芹、玉米麸表面生物膜吸收和降解的同时，玉米麸自身释放有机物，相比于IFB-LC，IFB-CF增加了有机物的产出量，所以IFB-LC比IFB-CF对COD的降解效果要明显。
3 微生物多样性分析
3.1 多样性分析
IFB-CF和IFB-LC的微生物种群多样性表征结果见表1所示。
从表1可知，玉米麸表面微生物的OTUs值明显高于轻质陶粒，说明玉米麸表面的微生物种类比陶粒表面的微生物种类相似度要高。Chao是度量物种丰富度的指标，它和丰度、均匀度无关，但是它对稀有的物种很敏感。并结合OTUs，玉米麸表面微生物的Chao大于轻质陶粒，说明玉米麸表面微生物群落丰富度高于轻质陶粒。同样ACE指标，玉米麸表面微生物大于轻质陶粒，这两个指标都说明玉米麸表面微生物群体丰富度大于轻质陶粒都表明IFB-CF对微生物量的积累是远远优于IFB-LC。玉米麸表面微生物的Shannon值高于轻质陶粒陶粒及玉米麸表面微生物的Simpson指数低于轻质陶粒，说明玉米麸表面微生物多样性优于轻质陶粒。由此可见，玉米麸表面微生物的OTUs，Chao，Shannon，ACE的四个指标都高于轻质陶粒，Simpson的指数小，反映微生物物种多样性越高，说明玉米麸表面微生物丰度和多样性都高于轻质陶粒。就群落水平而言，IFB-CF中种群多样性高的群落包含更多具有不同生物学和生态学特性的种群，系统稳定性更强。
3.2 稀释曲线
OTU是将序列按照一定的相似性分归为许多分类单元，一个单元就是一个OTU，通常在97%的相似水平下对序列进行OTU聚类分析。随着样品序列条数的增长，OTU数量也随之增长。其增长趋势可以用来比较不同样品中微生物群落复杂程度。玉米麸和轻质陶粒表面微生物表征结果见图2，轻质陶粒表面微生物稀释曲线趋势较玉米麸平缓，代表着陶粒表面的微生物群落复杂程度比玉米麸表面的微生物群落低。
3.3 门/属/科水平上的分类
根据高通量测序和微生物种群表征结果，玉米麸表面细菌由15个门、165个属、78个科组成，轻质陶粒表面细菌由15个门、144个属、93个科组成。玉米麸和陶粒表面细菌分布特性。
玉米麸表面优势菌种有Proteobacteria，Acidobacteria，Chloroflexi和Chloroplast相对丰度分别占细菌群落的48.29%，0.06%，0.01%和0.07%。而轻质陶粒以Proteobacteria最为丰富，其次是Bacteroidete。Bacteroidete中里还有Cytophaga，Cytophaga可以有效降解纤维素等复杂有机物，使水体中纤维素水解，更高效的提供碳源。
玉米麸表面上的优势菌属为Rhizobium、轻质陶粒表面上的优势菌属为Psedomonas，其相对丰度分别为3.52%和2.32%，它们都具有脱氮固氮功能。轻质陶粒表面的Nitrospira，其相对丰度为0.02%，它能够将亚硝酸氧化成硝酸，而玉米麸表面的Paenibacillus，其相对丰度为0.09%，它能够将硝酸盐还原到亚硝酸盐，与上述IFB-LC的NO3--N浓度要高于IFB-CF的NO3--N浓度现象吻合。
玉米麸和轻质陶粒表面的微生物优势种类有相似之处。例如：基于属水平上的物种组成结果，两种载体填料都含有Hydrogenophaga（氢噬胞菌属），Hydrogenophaga内有的种具有厌氧硝酸盐呼吸作用，从而具备反硝化作用。玉米麸表面含量为3.33%高于轻质陶粒表面的1.60%，从而IFB-CF的脱氮效果要优于IFB-LC。从门、属、科三个层面来看，IFB-LC微生物种类要略多于IFB-CF微生物种类，其原因是陶粒表面比玉米表面的比表面积大，有利于水芹根系在其载体表面生成生物膜，促使微生物的富集。对比研究发现，IFB-CF的Flavobacterium（解磷菌）含量为2.12%明显优于IFB-LC的1.52%；IFB-CF具有的Pseudomonas（杆菌，具有较强的脱氮能力）的数量要比IFB-LC少。
4 结论
①IFB-LC对COD的去除率为87%，IFB-CF对COD的去除率为66%，采用含有碳源来源的浮床对水体营养盐的去除优于人工合成材料的浮床。
②从物种多样性及系统稳定性的角度分析，玉米表面的物种量确实要丰富轻质陶粒表面，系统更加稳定。
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